DESARROLLO CIENTÍFICO DEL EVENTO TICAR
Dr. Fernando Bravo Almonacid (CONICET)
Las enfermedades causadas por virus afectan a toda la planta de papa. Se transmiten en forma vegetativa (por el uso de tubérculos semilla enfermos), mecánica (por contacto entre hojas, operarios o maquinarias) y, principalmente, por áfidos vectores (insectos que transmiten estos virus) (ver FIGURA 1(b)). No existen productos antivirales para el control de los virus vegetales. Los únicos medios de control son los manejos agrícolas, el uso de semillas libres de virus y el uso de insecticidas para eliminar los áfidos (vectores).
FIGURA 1: En la microscopía electrónica se observan las partículas del virus PVY (a) y a la derecha los áfidos vectores (b).
FIGURA 2: síntomas de la infección por PVY en hojas (a) y tubérculos (b).
FIGURA 3: estructura del Virus Y de la papa (PVY)
Una forma eficiente de introducir resistencia a virus es el mejoramiento genético convencional. Éste se basa en el cruzamiento entre individuos de la misma especie que muestran características diferentes, para luego seleccionar aquellos ejemplares que presentan las virtudes buscadas por el mejorador. En el caso de la papa, éste es un procedimiento lento y complicado, dadas las características genéticas de la especie. Además, la variedad Spunta (más del 90% de la producción para consumo fresco en Argentina) produce muy poca semilla botánica, lo que dificulta aún más los cruzamientos.
Resistencia a virus por ingeniería genética
Los enfoques biotecnológicos son los más eficaces para introducir resistencia a virus de plantas. Las tecnologías para ello existen desde 1986 y se han perfeccionado continuamente desde entonces. En la Argentina, la transformación genética de la papa está disponible desde 1989-90 en el INGEBI-CONICET (Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular). En 1999 el CONICET firmó un acuerdo con Tecnoplant SA para el desarrollo de plantas de papa de la variedad Spunta resistente a PVY.
Mecanismo de resistencia
Las plantas disponen de una amplia gama de dispositivos de defensa contra patógenos vegetales, pero no poseen un sistema inmune como el de los animales, basado en anticuerpos. En el caso de los virus de plantas, el mecanismo de defensa es altamente selectivo y se basa en reconocer la presencia del ADN o ARN del virus invasor y eliminarlo. Cada célula de la planta dispone de este mecanismo. Cuando un virus ingresa a la planta se inicia una carrera entre el virus y estos mecanismos de defensa. Dependiendo de quién gane esta carrera, se puede lograr un estado de elevada resistencia o inmunidad. Si la carrera la gana el patógeno, la planta se enfermará.
La tecnología aplicada en nuestro caso consiste en establecer permanentemente este mecanismo de defensa dirigiendo la resistencia en forma específica contra el virus PVY, un proceso similar a lo que produce una vacuna en el caso de humanos o animales, que activa y prepara al sistema inmune para la defensa contra un patógeno determinado.
El silenciamiento postranscripcional o PTGS (del inglés; Post-Transcriptional Gene Silencing), la modificación introducida por ingeniería genética en Spunta TICAR, afecta sólo la regulación de un mecanismo defensivo propio de la planta y no introduce ninguna característica nueva en la misma, excepto la resistencia a este virus particular. Es un proceso que permite la degradación de un ARN específico, en este caso el ARN del virus PVY.
FIGURA 4: funcionamiento del sistema de defensa contra virus de Spunta (derecha) vs. TICAR (izquierda).
Silenciamiento postranscripcional, un mecanismo de defensa natural de las plantas contra los virus
Como se ve en la FIGURA 4 (izquierda), cuando el virus PVY infecta una planta TICAR se encuentra con el mecanismo de defensa ya establecido, dado que la planta produce RNA doble cadena (dsRNA) que tiene homología con la secuencia del virus y es cortado por la enzima DICER en pequeños fragmentos denominados siRNA. Estos siRNAs son la guía para que un complejo de degradación (RISC) elimine el RNA que tiene homología con estos siRNAs, es decir el virus PVY. En cambio, como se observa en la FIGURA 4 (derecha), cuando PVY infecta una planta de papa Spunta, el virus o su RNA puede entrar a una célula y multiplicarse para dar lugar a nuevos virus, en consecuencia, la planta se enfermará, ya que no pudo desencadenar a tiempo el mecanismo de defensa (PTGS).
Este mecanismo ha sido utilizado para lograr plantas de papaya resistentes al virus PRSV. Estas plantas son cultivadas y comercializadas desde el año 1998 en Hawaii, y también aprobadas en Canadá y Japón. China también produce y comercializa papayas resistentes al PRSV desde 2006. Más recientemente, el mismo mecanismo se ha utilizado para obtener manzanas y papas que no sufren pardeamiento, gracias al silenciamiento de la enzima polifenol oxidasa, eventos ya aprobados para su comercialización en Estados Unidos y Canadá. También en Brasil, el EMBRAPA, desarrolló plantas de porotos resistentes al virus BGMV, y obtuvo la aprobación para su comercialización.
Simplot Plant Sciences, la segunda industria de bastones pre-fritos congelados del mundo, utiliza la misma tecnología aplicada en Spunta TICAR y ha obtenido la aprobación para su papa marca “Innate” en algunos mercados extranjeros clave, incluyendo Japón, y tiene varias otras solicitudes de acceso al mercado extranjero pendientes. Simplot obtuvo la aprobación para vender su primera generación Russet Burbank en Japón durante el mes de agosto de 2017. La primera generación de Innate Burbanks, Atlantics y de Ranger Russets - todas cultivadas para resistir moretones, además de evitar oxidarse después del corte y de poseer bajos niveles de acrilamida, que es un producto químico potencialmente nocivo generado durante la fritura de algunos alimentos con almidón - se aprobó la primavera pasada en Australia y Nueva Zelanda. La compañía también ha solicitado la aprobación de la primera generación en China, Corea del Sur, Taiwán, Malasia, Singapur y México, y tiene previsto pronto aplicar en Filipinas. Simplot ya ha recibido la aprobación de la segunda generación de variedades Innate en Canadá y los EE.UU.
En EUA, Simplot recientemente agotó su inventario de papas frescas Innate, comercializada bajo la marca blanca Russet, por tercer año consecutivo. Innate se distribuyó en aproximadamente 4.000 supermercados en 40 estados. Los minoristas y los profesionales del servicio de alimentos se han mostrado dispuestos a pagar una prima por las papas Innate, porque evitan contusiones, incluso al final de la temporada cuando el problema está muy extendido.
Desarrollo de Spunta TICAR, ensayos de campo, seguridad medioambiental y seguridad alimentaria. Liberación comercial.
Una vez conseguidos en laboratorio de INGEBI, una gran cantidad de eventos potencialmente resistentes a PVY (más de 400), se clonaron in vitro obteniendo microplántulas. Cada una de ellas era un clon con potencial resistencia a PVY. Las plantulas fueron aclimatadas y se realizaron ensayos de desafio con el virus en invernaderos (descartando 295 de esos clones) y luego en el campo (descartando otros 83 clones), lo que permitió seleccionar los clones de mejor comportamiento frente a la enfermedad y se los llevó a nuevos ensayos en el campo, en varias localidades, para realizar estudios de rendimiento y comportamiento en condiciones de producción.
Estos estudios se realizaron bajo estrictos controles sobre todos los procesos por parte de la Dirección Nacional de Biotecnología Agrícola, dependiente del ex Ministerio de Agroindustria de la Nación, y muy especialmente el seguimiento y evaluación permanente de la CONABIA[1].
En colaboración, personal de INGEBI-CONICET y de Tecnoplant realizaron los ensayos de campo que permitieron seleccionar dos eventos promisorios, resistentes al virus y avanzar hacia la liberación comercial.
Sucesivas selecciones en invernadero y nueve ensayos de campo en cuatro localidades distintas del país durante 1998 y 2001 (ver FIGURA 5) fueron definiendo los clones más prometedores hasta llegar a TIC-AR 233-5, que fue el seleccionado para ingresar en la Fase II de CONABIA, en la que hubo que cumplimentar una serie muy importante de exigencias y reglamentaciones, demostrando la bioseguridad ambiental del evento.
FIGURA 4: funcionamiento del sistema de defensa contra virus de Spunta (derecha) vs. TICAR (izquierda).
El evento elegido resultó inmune a PVY en ensayos durante los cuales se infectaron el 85% de las plantas Spunta control. Todos los ensayos fueron autorizados y aprobados por la CONABIA. La resistencia al virus fue confirmada en varias pruebas posteriores en las que se pudo constatar la ausencia de infección en las plantas TIC-AR, mientras que las plantas Spunta control mostraron distintos grados de infección.
En paralelo, se realizaron los análisis de aptitud alimentaria de la variedad TIC-AR 233-5. Se analizaron diferentes características fenotípicas y bioquímicas que demostraron que la composición y el valor nutricional de la variedad TIC-AR 233-5 son idénticos a los de la variedad Spunta original.
Para aumentar los niveles de seguridad ambiental de nuestro evento Spunta TICAR, se realizaron ensayos de flujo génico a campo, que permitieron comprobar la ausencia de transferencia horizontal hacia especies relacionadas y otras variedades de papa.
Toda esta información fue publicada en un artículo, Field testing, gene flow assessment and pre-commercial studies on transgenic Solanum tuberosum spp. tuberosum (cv. Spunta) selected for PVY resistance in Argentina – Bravo Amonacid, F., et al en la revista Transgenic Research.
Adicionalmente, se secuenció todo el genoma de la variedad TIC-AR 233-5. Dicha secuencia genómica fue comparada con el genoma de referencia de la papa, lo que permitió corroborar la consistencia de las modificaciones efectuadas, verificar el lugar donde ocurrió la inserción y asegurar la no ocurrencia de otras modificaciones indeseadas.
Durante el año 2014 la Dirección de Mercados Agrícolas del ex Ministerio de Agroindustria de la Nación realizó un informe positivo de impacto de mercado,. Asimismo, ante la llegada de un nuevo gobierno en 2017 se realizó una nueva evaluación de impacto en el mercado, llegando a idénticas conclusiones que las obtenidas en 2014.
Con fecha 29 de abril de 2015, la CONABIA aprueba el evento transgéncio TICAR, culminando así con el cumplimiento de sus exigentes requerimientos.
El 6 de octubre de 2015 se publicó en el boletín Ofical de la República Argentina la Resolución 399/2015 del ex Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca de la Nación, aprobando la comercialización del evento transgénico TICAR, sujeta a la presentación de información adicional requerida por SENASA. Esta información fue cumplimentada y para julio de 2018 el SENASA dio por aprobadas sus exigentes solicitudes de información y análisis, que garantizan la inocuidad alimentaria del evento para su consumo.
El 8 de agosto de 2018, por Resolución 65/2018 el ex Ministerio de Agroindustria de la Nación libera para su comercialización el evento transgénico de papa resistente a PVY Spunta TICAR 233-5.